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动物基因组 DNA 的提取
[实验原理]
在 EDTA 和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组 DNA，用此方法得到的DNA 长度为100-150
kb，适用于 L 嘴菌体构建基因组文库和 Southern 分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组 DNA 的原理和步骤，以及相对分子质量较大的 DNA 的 琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂]
(一 ) 仪器
1.台式离心机
2.玻璃匀浆器
3．高压灭菌锅
4．恒温水浴
(二 ) 材料
1．1.5mL微量离心管
2．微量取样器和吸头
3．无菌过滤器 ( 一次性)
4．10 mL注射器
5．鼠肝
6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)
7.十二烷基硫酸钠(SDS)
8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K
10．RNA酶
11．DNA相对分子质量标准物，DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物
(三 ) 试剂
1、1.5 mol/L NaCl
2、0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0
3．0.5 mol/L EDTA pH8.0
4．3 mol/L
NaAc pH5.2
以上均高压灭菌。
5．蛋白酶 K 10mg/mL 配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存 ( 教师配制)
6.组织匀浆液 100mmol/LNaCI，10mmol/LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol/LEDTA(pH8.0)
7．酶解液 200mmol/LNaCI，20mmol/L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol/LEDTA(PH 8.0)，200~g/mL 蛋白酶K，1%SDS
8．无 DNA 酵的 RNA 酶
：将胰 RNA 酶溶解于 10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L NaCl 溶液中，浓度 l0mg/mL，于
9．TE缓冲液：10mmol/LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol/LEDTA(pH8.0)
10．平衡酚 (pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1< 体积比)
11．氧仿：异戊醇 =24：l( 体积比)
12．5xTBE 5．4gTris，2．
2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；
13．6x上样缓冲液 o．25%溴酚蓝，40%(W/V) 蔗糖水溶液
14．λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125
[实验步骤]
本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝 DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA 酶的污染，特 g4 注童动作温和，减少对 DNA 的机械捌伤。
1、取
2、将组织细胞移至 1.5ml 离心管中，50000rpm离心 30-60sec，( 尽可能在低温下操作 )，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入1 倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
3、沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散，分两管，再加 0.4mL 酵解液，翻转混匀 ( 动作一定要轻 )
4、沉淀加 RNase 至终浓度 200µg/mL，
5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混勾，倾斜使两相接触面增大 )。
6、有时如果 DNA 含量过高，水相在下层，实验时应注意观察。用扩口吸头移出含 DNA 的水相 ( 注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等体积氧仿/异戊醇，
10 000rrpm离心 10rain ( 若界面或水相中蛋白含量多，可重复 1．6 操作)。
7、用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相，加 1/10 体积的 NaAc，小心混匀( 要充分 )，再向每管中加入2.5 倍体积的无水乙醇，-20 过夜。
8、12 000rpm离心 19min，弃上清，75%冷乙醇洗涤一次，12000rpm 离心 15min 室握温干燥 ( 不要大干，否则 DNA 不易溶解 )，加入适量TE 缓冲液，存放于
9、电泳鉴定 DNA，由于基因组DNA 相对分子质量较大，用 0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，先在底部锦一层1%的支持胶，凝固后再铺上一层0.3%琼脂糖凝胶，插上梳子( 枚子不能瑾到的支持胶 )。取1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上样缓冲液和 35µl 无菌水混匀后小心上样 ( 可在另一孔加 DNA 相对分于质量标准 )，观察基因组DNA 大小，用溴化乙锭染色观察结果。
[注意事项]
1、操作过程尽量在低温下进行，避免 DNA 降解。
2、琼脂糖凝胶脆弱，应小心操作。
3、提取得到的基因组 DNA 应为单一条带，DNA降解可形成弥散带型。
