基因定点突变

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基因定点突变

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性 克隆，再测序确定就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则：

（1）通常引物长度为 25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。 一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12 个bp才能与模板搭上，而这种突变 PCR 要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少 12 个bp，并且合成多一条反向互补的引物。

（2）如果设定的引物长度为 30 bp，接下来需要计算引物的Tm 值，看是否达到 78℃（GC 含量应大于40%）。

（3）如果 Tm 值低于 78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm 值达到 78℃（GC 含量应大于40%）。

    （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

    （5）最好使用经过纯化的引物。

      
Tm值计算公式：Tm=0.41×(%
of GC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；% of GC：引物 GC 含量。

四、引物设计实例

以 GCG→ACG 为例：

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

（1）首先设计 30 bp 长的上下游引物，并将 A (T) 设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

（2）引物 GC 含量为 40%，L 为30，将这两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm 低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

（3）重新调整引物长度。

Primer #1: 5’–CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’–CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加 5mer（斜体下划线处），这样引物的GC 含量为 45.7%，L 值为 35，将这两个数值带入Tm 值计算公式，得到其 Tm 为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后，当然就是做 PCR 喽，不过对于 PCR 的酶和 buffer，不能用平时的，我们做PCR 把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K，所以要用那些GC buffer 或扩增长片段的 buffer，另外，要用保真性能较好的PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒，如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的 金牌快速 taq 酶、Takara的PrimeSTAR^TM HS DNA polymerase。

六、如何去掉 PCR 产物

最简单的方法就是用 DpnI 酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR 产物都是没有甲基化的，所以 DpnI 酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而去掉模板留下 PCR 产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒

直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性 克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。

八、图示

正文完