凝胶迁移实验(EMSA)

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凝胶迁移实验(EMSA

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)可以:(1)研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用;(2)可用于 DNA 定性和定量分析;(3)用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。

1实验方法和原理

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究 DNA 结合蛋白,目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNARNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或 RNA- 复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测 RNA 结合蛋白时,依据目的 RNA 结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNARNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定 DNARNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

2实验材料、试剂、仪器耗材

DNA样品

[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED(四甲基乙二胺)、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等

水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等

 

3实验步骤

一、探针的标记

1. 如下设置探针标记的反应体系:

1)待标记探针 (1.75 pmol/ 微升 ) 2 微升。

2T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升。

3Nuclease-Free Water 5微升。

4[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) 1微升。

5T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升 ) 1 微升。

6)总体积:10微升

7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。

2. 使用水浴或 PCR 仪,37反应 10 分钟。

3. 加入 1 微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。

4. 再加入 89 微升 TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30% 以上,即总放射性的 30% 以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。

5. 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在-20

二、探针的纯化

通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善 EMSA 的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作

1. 对于 100 微升标记好的探针,加入 1/4 体积即 25 微升的 5 M 醋酸铵,再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇,混匀。

2. -70-80沉淀 1 小时,或在 -20 沉淀过夜。

3. 412 000 g-16 000 g 离心 30 分钟。小心去除上清,切不可触及沉。

4. 412 000 g-16 000 g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。

5. 加入 100 微升 TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3 天。标记好的探针可以保存在 -20

三、EMSA 胶的配制

1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

2. 按照如下配方配制 20 毫升 4%的聚丙烯酰胺凝胶( 注意:使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis 对结果影响不大)

1TBE buffer (10X) 1毫升。

重蒸水:16.2毫升。

239:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升。

380% 甘油: 625微升。

410% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150 微升。

5TEMED 10微升

3. 按照上述次序加入各个溶液,加入 TEMED 前先混匀,加入 TEMED 后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡,并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

四、EMSA结合反应

1. 如下设置 EMSA 结合反应

阴性对照反应:

1Nuclease-Free Water 7微升。

2EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) 2 微升。

3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 0微升。

4)标记好的探针
1微升。

5)总体积
10微升。

样品反应:

1Nuclease-Free Water 5微升。

2EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) 2 微升。

3)细胞核蛋白或纯化的转录因子
2微升。

4)标记好的探针: 1微升。

5)总体积: 10微升。

探针冷竞争反应:

1Nuclease-Free Water 4微升。

2EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) 2 微升。

3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2微升。

4)未标记的探针: 1微升。

5)标记好的探针: 1微升。

6)总体积
10微升。

突变探针的冷竞争反应:

正文完
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