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凝胶迁移实验（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用；（2）可用于 DNA 定性和定量分析；（3）用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。
1实验方法和原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究 DNA 结合蛋白，目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNA 或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或 RNA- 复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2实验材料、试剂、仪器耗材
DNA样品
[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等
水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等
3实验步骤
一、探针的标记
1. 如下设置探针标记的反应体系：
（1）待标记探针 (1.75 pmol/ 微升 ) ：2 微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升 ) ：1 微升。
（6）总体积：10微升
（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
2. 使用水浴或 PCR 仪，37℃反应 10 分钟。
3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
4. 再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30% 以上，即总放射性的 30% 以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。
二、探针的纯化
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善 EMSA 的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作
1. 对于 100 微升标记好的探针，加入 1/4 体积即 25 微升的 5 M 醋酸铵，再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇，混匀。
2. 在 -70℃ 至-80℃沉淀 1 小时，或在 -20℃ 沉淀过夜。
3. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 离心 30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
4. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
5. 加入 100 微升 TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3 天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
三、EMSA 胶的配制
1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
2. 按照如下配方配制 20 毫升 4%的聚丙烯酰胺凝胶( 注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis 对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。
重蒸水：16.2毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。
（3）80% 甘油： 625微升。
（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150 微升。
（5）TEMED ：10微升
3. 按照上述次序加入各个溶液，加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、EMSA结合反应
1. 如下设置 EMSA 结合反应
阴性对照反应：
（1）Nuclease-Free Water ：7微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。
（4）标记好的探针
：1微升。
（5）总体积
：10微升。
样品反应：
（1）Nuclease-Free Water ：5微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子
：2微升。
（4）标记好的探针： 1微升。
（5）总体积： 10微升。
探针冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液 (5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。
（4）未标记的探针： 1微升。
（5）标记好的探针： 1微升。
（6）总体积
：10微升。
突变探针的冷竞争反应：
