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mRNA的分离纯化
【实验原理】
真核生物的 mRNA 分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是 mRNA 的翻译产物,因此,高质量 mRNA 的分离纯化是克隆基因、提高 cDNA 文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约 1×10-5g RNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。其中 rRNA 为75%~ 85%,tRNA占 10%~16%,而mRNA 仅占 1%~5%,并且mRNA 分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰度也不一样。
真核生物 mRNA 有特征性的结构,即具有 5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A) 尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的 3’端存在20~300 个腺苷酸组成的 poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,这种结构为真核mRNA 分子的提取、纯化,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。
一般 mRNA 分离纯化的原理就是根据 mRNA 3’末端含有多poly(A) 尾巴结构特性设计的。当总 RNA 流经寡聚(dT)(即 oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异地吸附在 oligo(dT) 纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次 oligo(dT) 纤维素柱,即可得到较纯的mRNA。
目前常用的 mRNA 的纯化方法有:
(1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离 mRNA 的标准方法;
(2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA 溶液中并使 mRNA 与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;
(3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。
本实验应用方法(1)进行 mRNA 的分离纯化。
【试剂与器材】
(一)试剂
1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL
2. 寡聚 Oligo(dT)– 纤维素
3. 加样 / 洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH
7.6),每组250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1%
SDS。
4. 洗涤缓冲液 2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L
EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS 至终浓度。
5. 5 mol/L NaCl,每组10mL
6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL
7. 无 RNase 双蒸水 (DEPC 水),每组100mL
8. 70%乙醇,每组10mL
注意:溶液 5,6 的配制都应该加 0.1% DEPC 处理过夜,溶液 1,3,4,8 则用经 0.1% DEPC 处理过的无 RNase 双蒸水配制,Tris应选用无 RNase 的级别。溶液配制后,最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如 10ml 或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
(二)器材
1. 恒温水浴箱
2. 冷冻高速离心机
3. 紫外分光光度计
4. 巴斯德吸管
5. 玻璃棉
6. 5ml一次性注射器
【操作方法】
(一) oligo(dT)纤维素的预处理
1. 用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素。
2. 将悬浮液装入填有经 DEPC 水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为 0.5-1.0mL,用3 倍柱床体积的无 RNase 的灭菌双蒸水冲洗 oligo(dT) 纤维素。
3. 用 3-5 倍柱床洗涤缓冲液 I 冲洗 oligo(dT) 纤维素,直到流出液的 pH 值小于8.0。
4. 将处理好的 oligo(dT) 纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液 I 悬浮,浓度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。
(二)
总 RNA 浓度的调整
1. 把实验一所提的总 RNA 转到适合的离心管中,如果总 RNA 的浓度大于 0.55mg/mL,则用无RNase 的双蒸水稀释至 0.55mg/mL,总RNA 的浓度对除去 rRNA 是很重要的。把 RNA 溶液置于 65℃水浴加热5 分钟,然后迅速插在冰上冷却。
2. 加入 1/10 体积 5 mol/L NaCl 使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。
(三) mRNA的分离
1. mRNA与 Oligo(dT)- 纤维素结合:用移液器重新悬浮 oligo(dT)- 纤维素,按下表取适量的 oligo(dT)- 纤维素到 RNA 样品中,盖上盖子,颠倒数次将 oligo(dT)- 纤维素与 RNA 混匀。于 37℃水浴保温并温和摇荡15 分钟。
总RNA (mg)
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寡聚 Oligo(dT)- 纤维素(mL)
|
洗涤缓冲液1,2 (mL)
|
洗脱体积(mL)
|
<0.2
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0.2
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1.0
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1.0
|
0.2-0.5
|
0.5
|
1.5
|
1.5
|
0.5-1.0
|
1.0
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3.0
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3.0
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1.0-2.0
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2.0
|
正文完
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