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1 探针的设计与合成
1) 根据实验室已有的 p8 基因 cDNA 全长序列，用 premier primer5.0 设计引物 p81 和p82，以卤虫 cDNA 为模板，PCR扩增得到 346bp 的产物，用 Takara 胶回收试剂盒回收纯化。
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引物编号
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引物序列
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长度
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p81
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TGCGGACGAAACAGGAAG
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18 bp
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p82
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GCTCAAACAGTGATGCCAGT
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20 bp
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2) 目的片段克隆
a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：
目的 PCR 片段 5 μl
pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl
10×T4
DNA Ligation Buffer 1 μl
T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl
无菌去离子水 3 μl
总体积 10 μl
b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于 PCR 仪中
c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入 16 μl 的IPTG（50mg/ml）、40 μl的 X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于
d. 将 10 μl 的连接产物加到 100 μl DH5a 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于
e. 挑取白色菌落直接进行 PCR 检测，筛选转化子。
f. 将转化子接种于 LB 液体培养基中培养 24 小时，吸取 1mL 菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。
3) 重组质粒的线性化
取 6 μl 以测序的重组质粒，选取 NcoI 内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl：
质粒 6 μl
10xK Buffer 2 μl
NcoI酶 1 μl
0.1% BSA 2 μl
灭菌水 9 μl
终体积 20 μl
取酶切前后的质粒各 4 μl，经1% 琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用 Takara 胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。
4) 探针合成
按罗氏 DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) 试剂盒使用指南，标记反义 RNA 探针。
使用的所有试剂和器皿均经去 RNase 处理，合成方法如下 : 先准备反应体系。冰上向 RNase-Free 的微离心管中顺序加入下列试剂:
纯化的线形质粒 1 μg
Rnase-free dH2O up to 13 μl
10xNTP labeling mixture 2 μl
10xTranscription buffer 2 μl
Rnase inhibitor 1 μl
SP6 RNA Polymerase 2 μl
总体积 20 μl
稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37℃ 2 h。反应结束后再补加 2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取 3-5 μl 反应产物 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存备用。
2. 石蜡切片的制备
◆本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free. 玻璃器皿采用
1) 组织的固定与包埋
选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经 DEPC 处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的 4% 多聚甲醛，于 4℃固定5-8 h，再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30% 乙醇脱水 1 h，50% 乙醇脱水 1 h，70% 乙醇脱水 1 h，80% 乙醇脱水乙醇脱水 1 h，90% 乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1
h，无水乙醇 : 二甲苯 (1:l) 透明 10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1) 浸蜡30 min，54℃石蜡浸蜡1 h，54℃石蜡包埋。
2) 组织切片：将包埋的组织按 7 μm 的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加 DEPC 处理水，组织片于42<
